中文字幕免费无码专区剧情_免费一级?毛片在线播放高清视频_午夜精品天堂av_日韩免费卡一卡二新区_免费又爽又黄禁片视频1000_亚洲无码?V制服另类专区_欧美在线不卡视频播放_国产欧美va天堂在线观看视频

制備方法：

采用人骨髓來源細(xì)胞使用化合物三甲基膽蒽（MCA）誘導(dǎo)產(chǎn)生并篩選出細(xì)胞，并使用該細(xì)胞在體外合成性雌二醇；所述細(xì)胞已由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號(hào)CCTCC C2012173；

制備步驟為：

（1）人骨髓來源細(xì)胞（HMBDCs，主要成分為人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞）采用現(xiàn)有技術(shù)（本實(shí)施例采用骨髓沖洗、貼壁法）進(jìn)行原代培養(yǎng)制備，制備的細(xì)胞培養(yǎng)于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，直至105個(gè)細(xì)胞/培養(yǎng)瓶；

（2）培養(yǎng)基中加入MCA，使其終濃度為1ug/ml，并每星期更換含MCA的培養(yǎng)基2次；MCA處理1周后結(jié)束；細(xì)胞在37℃，5%CO2環(huán)境中，持續(xù)常規(guī)培養(yǎng)；

（3）培養(yǎng)至3個(gè)月，培養(yǎng)物中可見細(xì)胞中出現(xiàn)生殖細(xì)胞樣細(xì)胞；上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)生殖細(xì)胞的標(biāo)志物：Oct4、Nanos3、c-Kit、DAZL、Vasa；

（4）培養(yǎng)液中檢測(cè)到雌二醇的持續(xù)表達(dá)，與未經(jīng)誘導(dǎo)處理hBMDCs（E2=65±14.8pmol/L， n=6）相比，MCA誘導(dǎo)后hBMDCs中（E2=3243±947 pmol/L， n=6）雌二醇的濃度高達(dá)50倍（p<0.01）差異有顯著性；重新傳代后，觀察到隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，雌二醇濃度進(jìn)行性增加，傳代培養(yǎng)至10天左右達(dá)到高峰，高達(dá)4500pmol/L，隨后逐步下降，最終維持到較高水平；

（5）體內(nèi)雌二醇是由卵巢中卵泡合成，在體外培養(yǎng)的誘導(dǎo)后hBMDCs中，觀察到卵泡樣結(jié)構(gòu)的形成（為誘導(dǎo)后hBMDCs中產(chǎn)生雌激素提供細(xì)胞支持）；卵母細(xì)胞的發(fā)育需雌二醇的促進(jìn)，若缺乏雌二醇，卵母細(xì)胞的最大只能長(zhǎng)到25微米；而誘導(dǎo)后hBMDCs中的卵母細(xì)胞樣細(xì)胞體積達(dá)到40-50微米；免疫熒光證實(shí)上述大細(xì)胞為卵母細(xì)胞；

（6）卵泡相關(guān)基因，包括雌二醇合成的關(guān)鍵性基因：STAR、p450arom、p450c17，以及卵泡發(fā)育相關(guān)基因GDF9在培養(yǎng)物中表達(dá)（進(jìn)一步支持誘導(dǎo)后hBMDCs具有合成雌二醇的能力）；

（7）優(yōu)化培養(yǎng)條件，增加雌二醇產(chǎn)生的能力，并降低培養(yǎng)液中血清的濃度（有利于雌二醇的進(jìn)一步分離純化）；上述生殖細(xì)胞樣細(xì)胞可進(jìn)一步增大產(chǎn)生早期卵泡樣結(jié)構(gòu)和卵母細(xì)胞樣細(xì)胞；

（8）按現(xiàn)有方法分離、純化，制得雌二醇。