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1.提蛋白

（不同細胞類型的蛋白或細胞不同部位的蛋白提取方法或有不同，需要提前查找資料）

我用的是凱基生物公司的全蛋白提取試劑盒 一般是取100 mg 標本 + 1 ml lysis buffer + 10 ul 磷酸酶抑制劑 + 10ul PMSF + 1 ul 蛋白酶抑制劑 放入研磨器研磨，直至研磨成勻漿（注意冰上操作，有的試劑盒說明在研磨時加液氮），倒入EP管，放入離心機離心，12,000 g / 5 min，取上清。

另一種提蛋白試劑，用RIPA buffer (Gibco) + 1% cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor (Sigma)

20mg樣品（盡量吸盡PBS） + 150 ul RIPA 溶液

冰上放置5~30min（趕時間可短）

蛋白定量-BCA測定方法（酶標板操作）

（如果不同樣品總蛋白表達量以及蛋白組分差異大，總蛋白調(diào)齊之后還需要看內(nèi)參蛋白的表達是否一致，最后可根據(jù)內(nèi)參蛋白調(diào)整上樣量）

BSA標準品一般需用PBS稀釋液稀釋（按照protocol來）。釋待測樣品至合適濃度，使樣品稀釋液（稀釋后濃度一般不超過測得標準品的最高濃度），總體積為20 μL。據(jù)樣品數(shù)量，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B ( 50:1 ) 配制適量BCA工作液，充分混勻，每孔加入200 μL BCA工作液。

37℃放置30分鐘（可調(diào)整時間）后，以標準曲線0號管做參比，在562 nm波長下比色，記錄吸光值。以蛋白濃度 ( μg/ul )為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪出標準曲線。

繪制標準曲線 y = 0.554x+0.0034

據(jù)所測樣品的吸光值（此處為y值）Average of triplicate， 代入y = 0.554x+0.0034 得到蛋白濃度x值，乘以稀釋倍數(shù)。根據(jù)蛋白上樣量確定體積（如上樣總體積16ul (加 混勻的4x Laemmli+β-巰基乙醇 煮沸變性)，上樣量20ug，測得蛋白濃度5ug/ul，則取蛋白提取液體積 volume = 20/5 = 4ul），補PBS 8ul，再加4x Laemmli 4ul, 使上樣體積相等。一般99℃水浴變性5min（變性可嘗試不同時間，如3min、7min或更長），保存于-80℃。

（4x Laemmli 也可換成 5x loading buffer）加入5x loading buffer (即80ul 樣本 加 20ul loading buffer )，搖勻，可用封口膜封口 (防止煮沸時EP管口因壓力高而彈開) 煮沸變性（溫度時間根據(jù)蛋白可做相應調(diào)整）。

2. wb

2.1 配膠

蛋白分子量大小不同，所使用的分離膠濃度也不同，常用濃度有6%、8%、10%、12%，分子量越大，所用的膠濃度越低，蛋白電泳速度越快。濃縮膠濃度均為 5%。分離膠的選擇：蛋白分子量很小時，推薦使用10-12%，例如蛋白分子量為 21kd 和 34kd ，選取的膠濃度為10%；分子量80kd，選10%；分子量180kd，選6%。

[電泳液也可用BIO-RAD 10x Tris/Glycine/SDS buffer, 直接取100ml buffer + 900ml 純水稀釋即可。配膠可用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%或其它濃度]

加樣之前先簡單介紹一下。一般wb、免疫熒光、免疫組化等組織病理學實驗樣本要求是每組不低于3個，需要相互比較的組別加樣時放于同一塊膠上。測目標蛋白之前先跑內(nèi)參蛋白，檢測各樣本的蛋白提取量是否相近。內(nèi)參蛋白量一致，再測目標蛋白。一般我用GAPDH作為內(nèi)參蛋白（不同組織有區(qū)別），分子量~35kd。marker作為指示劑可以顯示目標蛋白所處的條帶位置及大概分子量，一般加3～5ul。至于目標蛋白，不同蛋白表達量不同，一般10～20ug，可根據(jù)第一次的結(jié)果進行調(diào)整。

2.2 電泳

電泳時長一般1.5h，先用80v 跑~30min，使各樣本處于同一水平，待marker開始分離后將電壓調(diào)至120v 再跑~1h。待loading buffer提示快跑出分離膠時，準備配制轉(zhuǎn)膜液。配方如圖。

2.3 轉(zhuǎn)膜（濕跑法）

轉(zhuǎn)膜是整個wb過程中最重要的一步。Glycine14.1 g + Tris 3 g +800 ml 純水配好后，放入冰袋預冷，之后加甲醇 800ml。PVDF膜一般為2 x 8 cm 大小。PVDF膜和膠要時刻保持濕潤，不能干。將PVDF膜放入裝有甲醇的培養(yǎng)皿中活化~15秒，再倒入轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜時要注意趕走膜與膠之間的氣泡。轉(zhuǎn)膜板如下圖，在兩層濾膜之間依次放入膠和PVDF膜（膠對應轉(zhuǎn)膜板黑色面/儀器黑色面-連接電源負極，PCDF膜對應轉(zhuǎn)膜板透明面/白色面/儀器紅色面-連接電源正極）。注意轉(zhuǎn)膜儀器正負極與電源相對應。

轉(zhuǎn)膜時長和蛋白分子量有關(guān)，一般100 kb以內(nèi)的蛋白，轉(zhuǎn)膜時長1kb / 1min，大于100kb，改為1kb / 1.5分鐘。一般是恒流 200mA，加冰袋；分子量大時，可用300mA，隔1h 換1次冰袋，因為轉(zhuǎn)膜過程會產(chǎn)生大量熱量，避免儀器燒壞。

（半干轉(zhuǎn)膜法）

可用BIO-RAD Trans-Blot Turbo 5x Transfer Buffer (1份 20ml) + ethanol (1份 20ml) + nanopure water (3份 60ml) (需預冷)

2A~2.5A，恒壓25V，10min（可根據(jù)需要改變條件）BIO-RAD儀器。

2.4 封閉和敷一抗

將PVDF膜放入封閉液（1% milk in 1x TBST + 0.1% Tween 20 ）中，室溫下封閉~1h，也可根據(jù)需要延長至1.5h。封口膜大小一般3.5 x 10.5cm（可用封閉盒，盡量用純水或TBST清洗）。置于搖床上慢速搖~1h后，置于4℃冰箱過夜。

（驗證抗體很重要）

2.5 敷二抗和顯影

取出PVDF膜（條帶），用TBST洗滌3次，5min /次。若抗體效價不是很好，可適當延長每次的洗滌時間。再用相同的封閉液稀釋二抗，置于搖床上搖1h。之后取出條帶再用TBST洗滌3次，5min /次。配顯影液，我用的是MILLIPORE品牌的，比例1:1，注意避光(可用錫箔紙)。每條帶滴約200ml 顯影液。

顯影成像時因不同曝光時間會影響成像效果，最好取欠曝光，適度曝光以及過度曝光多個曝光時間，取差異最大的圖像。

tips: 剛從新鮮組織提前的蛋白記得搖勻分裝，應盡量在早期多做點wb條帶圖，便于后期數(shù)據(jù)補充分析，提取的蛋白存放時間久以及反復凍融，會導致蛋白降解，影響結(jié)果的準確性。

wb房間沒有空調(diào)，夏天溫度太高導致膠很快就凝了，可以將玻璃板放在冰上預冷，冬天用純水可以壓平分離膠，夏天可以用異丙醇壓平。

TEMED具有神經(jīng)毒性和揮發(fā)性，應在通風口處使用，避免搖晃，避光低溫存儲。

因答主測量的蛋白分子量比較靠近，之前一塊膠只轉(zhuǎn)了一個蛋白，最近在想直接對整塊膠進行轉(zhuǎn)膜，對不同蛋白進行半定量分析，這樣既能減少上樣誤差，還可以直觀的看出不同蛋白間的變化趨勢。所以試了下對整塊膠進行轉(zhuǎn)膜，加入兩種抗體，此處一抗種屬來源不同，因此二抗也不一樣，最后條帶結(jié)果并不理想。目前還在摸索是否為抗體濃度的因素。

另外，如果是發(fā)好的paper，建議將膜保留下來，注意保濕（可保存8～9個月），部分投稿雜志會要求作者提供。

今天面試，教授們提了一個問題，希望與大家共勉。如何確定wb中特異性抗體結(jié)合的蛋白就是我們要的目標蛋白，首先可以根據(jù)分子量大小判斷，可以做共沉淀把目標蛋白拉下來送去做質(zhì)譜。可以對膜上的蛋白做色譜和質(zhì)譜聯(lián)合分析，另外特異性染色也可以做，抗二抗的抗體可以購買或者自己制作。

通過向同學深入的學習，還可以做陰性對照和陽性對照。陰性對照（確定不表達或極微量表達目標蛋白的樣品），比如基因敲除動物，對動物做DNA鑒定，確定沒有該蛋白對應的基因序列，再提取蛋白做wb。陽性對照（確定表達目標蛋白的樣品），比如某種模型或正常組就是會比該種實驗模型的表達高，可以做wb進行比較。

技術(shù)是一種手段，但是嚴謹?shù)目蒲兴季S以及善于探索很重要。