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細(xì)胞冷凍實(shí)驗(yàn)是通過特定的冷凍技術(shù)和保護(hù)劑，將細(xì)胞置于低溫環(huán)境（-80℃或液氮）中，抑制細(xì)胞代謝，實(shí)現(xiàn)長期保存的實(shí)驗(yàn)方法。核心作用是長期保存細(xì)胞系、減少細(xì)胞傳代過程中的變異和損耗、備份珍貴細(xì)胞（如原代細(xì)胞、工程細(xì)胞），是細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中關(guān)鍵步驟——做好細(xì)胞冷凍，才能避免“養(yǎng)細(xì)胞半月，凍存一天全白費(fèi)"的尷尬。分4個(gè)模塊（凍前準(zhǔn)備、冷凍操作、凍后儲(chǔ)存、復(fù)溫復(fù)蘇）。

1.凍前準(zhǔn)備

（1）細(xì)胞準(zhǔn)備

選擇對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞（活性最高，凍存后復(fù)蘇率高），提前1-2天換液，確保細(xì)胞匯合度達(dá)到70%-80%，無污染、長勢良好。

（2）試劑準(zhǔn)備

配制凍存液（常用比例：培養(yǎng)基70%+血清20%+DMSO 10%，DMSO為細(xì)胞保護(hù)劑，需提前預(yù)冷），準(zhǔn)備凍存管、離心機(jī)、移液槍等無菌器材。

（3）環(huán)境準(zhǔn)備

無菌操作臺(tái)消毒，提前預(yù)冷離心機(jī)、凍存盒（程序降溫盒），確保操作環(huán)境無菌、溫度達(dá)標(biāo)。

2.冷凍操作

（1）細(xì)胞收集

消化對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，離心（1000r/min，5min），棄上清液，輕輕吹打細(xì)胞沉淀，制成單細(xì)胞懸液。

（2）加凍存液

緩慢加入預(yù)冷的凍存液，輕輕吹打混勻，避免劇烈震蕩損傷細(xì)胞。

（3）分裝與標(biāo)記

將細(xì)胞懸液分裝至凍存管（每管1-2ml），擰緊管蓋，標(biāo)記細(xì)胞名稱、凍存日期、操作者。

（4）程序降溫

將凍存管放入程序降溫盒，置于-80℃冰箱過夜（緩慢降溫，速率約1℃/min），避免直接放入-80℃導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。

3.凍后儲(chǔ)存

（1）短期儲(chǔ)存

-80℃冰箱可保存1-3個(gè)月，期間避免反復(fù)開關(guān)冰箱門，防止溫度波動(dòng)。

（2）長期儲(chǔ)存

過夜降溫后，將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐（-196℃）中保存，轉(zhuǎn)移過程動(dòng)作要快，避免凍存管升溫。

4.復(fù)溫復(fù)蘇

（1）快速復(fù)溫

從液氮罐中取出凍存管，立即放入37℃水浴鍋中，快速搖晃，1-2min內(nèi)解凍（避免緩慢解凍形成冰晶，損傷細(xì)胞）。

（2）無菌處理

解凍后，將細(xì)胞懸液緩慢加入預(yù)溫的培養(yǎng)基中，輕輕混勻，離心（1000r/min，5min），棄上清液（去除DMSO，避免DMSO損傷細(xì)胞）。

（3）復(fù)蘇培養(yǎng)

加入新鮮培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻，接種至培養(yǎng)瓶，置于37℃、5%CO?培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h后換液，觀察細(xì)胞貼壁和生長情況。